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選擇抗體時的“九個大坑”,您中招了嗎?

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最近咱們技術部門的小姐姐接到好多用戶朋友的咨詢,說“不了解正在研究的蛋白用哪個抗體合適”。

也有用戶朋友經常詢問“說明書中寫著可以用于ICC/IF,那我做組織的熒光成像是可以的吧?

其實在選擇正確抗體的道路上,存在很多“坑”,只要成功避開,就可以選到最適合您實驗的抗體。

今天就來和大家分享一下“如何選擇正確的抗體”。

1、蛋白的名稱和亞型

咱們銷售員經常拿到一些“似是而非”的英文名稱或簡稱,查的時候不確定推薦的是否就是用戶要檢測的靶標。針對這個問題,建議大家參考SwissProt蛋白數據庫,每個abcam說明書的 “數據庫鏈接”部分,有針對不同種屬的基因和蛋白數據庫鏈接, 其中顯示SwissProt的就是該蛋白的數據庫鏈接,點擊進去後,在頁面的左邊有篩選框,可以點擊您感興趣的部分查看。

點擊Names&Taxonomy部分,可以看到該靶標的基因名稱和蛋白名稱,以及替代名稱,也就是所謂的“小名”,看下您提供的名稱是否可以對應上,如此判斷該抗體是否適合。

另外,關于蛋白亞型問題,在這裏也可以找到答案,點擊Sequences部分,可以看到該蛋白有幾個亞型,每個亞型的具體氨基酸序列和分子量大小,如果您正好做WB實驗,就可以預估您的實驗結果,即可能檢測到的條帶位置。

不能不說,SwissProt數據庫實在太強大了,咱們用戶常常問到的亞細胞定位-Subcellular location,翻譯後修飾-PTM/Processing部分,具體的修飾位點和修飾基團等,都可以一一查看到。

1、抗體的應用範圍

常見的免疫學實驗,在abcam的說明書中,主要包括如下幾種應用:WB, IHC-P,IHC-Fr,IHC-FrFl,IHC-Wmt,IHC-FoFr,ICC,ICC/IF,IP,ChIP,ChIP/Chip,ELISA,EM,Flow Cyt等等,相信大家看到這些英文單詞也會一頭霧水吧,單單一個免疫組化-IHC,就可以細分這麽多操作方式,而且在不同的品牌,不同英文單詞代表的含義還不盡相同,建議大家在選購前,詢問清楚不同品牌對應的定義和質保範圍。

如在abcam産品說明書中,IHC-P即免疫組化石蠟切片,且實驗室內部驗證時,是搭配酶標二抗,用DAB顯色的方式檢測的;IHC-FR即免疫組化冰凍切片,內部驗證時,是搭配熒光二抗,用熒光成像的方式檢測的;IHC-FoFr是冰凍灌注切片;IHC-FrFI是冰凍切片漂片;ICC/IFICC都是特指細胞水平的熒光成像,值得注意的是,這裏ICC/IF裏的IF很多人會誤認爲既包括組織也包括細胞的熒光成像,導致選錯抗體,做不出結果。

2、抗體能識別的樣本種屬

常見的檢測種屬,經常如下描述:ReactivityHuman, Mouse, Rat, Sheep, Rabbit, Chicken, Hamster, Cat, Dog, Carp, African green monkey, Opossum, Chinese hamster, Common marmoset, Meriones unguiculatus.

有時還會見到如下描述predicted: Cow, Pig, Mammals

請大家務必注意:在abcam的說明書裏,Reactivity後面列到的種屬是可以質保的,而predicted到的種屬則是根據該蛋白在不同物種中的同源性比對數值,做出的推測。推測的種屬並沒有經過實驗室驗證,是不能質保的,僅供參考。

3、抗體的動物來源

抗體的動物來源即抗體的宿主物種,常見的有RabbitMouseRatChickenGoatSheep等,當您選購抗體時,建議盡量選和檢測樣本種屬不同的宿主物種,即您檢測mouse,盡量選擇非mouse來源的抗體,可以選rabbit源的抗體。

4、制備抗體的免疫原

在說明書中的免疫原,即Immunogen 部分,經常如下描述,Synthetic peptide within Human X aa 200-250. The exact sequence is proprietary.或者Recombinant full length protein corresponding to X這裏的X指的是蛋白的名稱).建議您根據您的實驗目的,去選擇合適的抗體,如果您沒有特殊實驗要求,那麽全長的免疫原序列是不錯的選擇。

5、單克隆抗體和多克隆抗體

經常有用戶問到,單克隆還是多克隆抗體好?其實在回答這個問題前,我們要先解釋下這兩者的含義,簡單來講,單克隆抗體只能識別抗原的特定抗原表位,而多克隆抗體可以識別抗原的多個抗原表位,所以,單克隆抗體特異性高而靈敏度相對低一些,多克隆靈敏度高而特異性低一些,在不同實驗操作時,可以根據如下表格有側重選擇。

 

 

 

單克隆抗體

多克隆抗體

特異性

 ++

 +

批間差

 ++

 +

靈敏度

 +

 ++

WB

 +

 ++

IHC

 +

 ++

ICC

 ++

 +

FlowCyt

 ++

 +

 

 

6、抗體的克隆號

克隆號是指定給單克隆雜交瘤細胞産生的抗體的編號。每個雜交瘤細胞克隆産生單個純同質型抗體。克隆號相同的抗體代表制備抗體時的免疫原序列是相同的。

7、抗體的偶聯物

常見的偶聯物有酶、熒光素、生物素等,常見的酶有辣根過氧化物酶-HRP、堿性磷酸酶-AP等,常見的熒光素有傳統熒光素FITCAPCPePe-cy3Pe-cy5等,新型熒光素包括Alexa Fluor® 系列和DyLight® 系列各波長的熒光素,一般做多重免疫染色時,會考慮選擇直接標記熒光素的一抗,建議您先核實實驗室儀器的熒光顯微鏡或流式細胞儀的配置,選擇匹配儀器的激發波長或通道的熒光抗體,盡量避免光譜重疊。

如果您需要尋找雙標記和三標記免疫熒光染色實驗中的常見組合,我們推薦如下:

免疫染色

抗體組合

雙色

Alexa Fluor® 488和Alexa Fluor® 647

三色

Alexa Fluor® 405、Alexa Fluor® 555和Alexa Fluor® 647

 

 

8、抗體驗證

這裏我們重點說下目前最具說服力的基因敲除驗證,KO驗證,該方法使用單倍體細胞模型的 CRISPR/Cas9 KO 人類細胞系。敲除模型是真正意義上的陰性對照,是抗體驗證的絕佳標准品。

基因敲除模型通過觀察基因功能缺失的表型來了解特定基因的功能,這正是該模型的強大之處。目前,abcam有超過1600種的經過敲除驗證的抗體,過去的一年中,還將 200 多種非特異性抗體從abcam的産品目錄中移除。當然敲除驗證僅是爲提高抗體質量標准所采取的衆多步驟之一。

以上就是在抗體選擇道路上常常遇到的問題,希望對大家有所幫助。廣州東銳科技有限公司和廣州新晉生物科技有限公司作爲abcam在華南區的一級授權代理商,爲您的科研保駕護航,幫助您更快地達成科研使命。

 

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